Qual DAISOGEL é melhor para a purificação de peptídeos recombinantes?

Os peptídeos recombinantes são terapêuticos produzidos a partir do método do DNA recombinante, uma técnica que permite a produção de peptídeos muito mais longos e complexos. A produção começa com a fermentação usando um hospedeiro microbiano, como o microrganismo bacteriano E. coli, ou um microrganismo à base de levedura, como S. cerevisiae ou, mais recentemente, a metilotrófica Pichia pastoris.

Esses microrganismos são projetados para expressar o peptídeo recombinante de interesse durante o processo de fermentação. Diferentemente do método sintético de produção de peptídeos, o método recombinante produz uma quantidade significativa de resíduos de células hospedeiras, proteínas glicosiladas e outras impurezas que devem ser removidas após a colheita. Além disso, os peptídeos recombinantes são propensos à dimerização, agregação e fibrilação. Portanto, o processo de produção de recombinantes requer várias etapas de processamento downstream, inclusive várias etapas de cromatografia, para atingir a pureza desejada. Não é incomum que uma etapa de cromatografia de troca iônica (IEX) e uma ou duas etapas de cromatografia de fase reversa (RPC) sejam implementadas na produção de GMP.

Purificação por cromatografia de fase reversa

Aqui, vamos nos concentrar nas etapas de fase reversa. Há várias considerações ao selecionar a fase estacionária ideal para a purificação de peptídeos recombinantes. O gel de sílica é o substrato mais comum 

O gel de sílica de fase reversa é usado para a purificação de peptídeos em fase reversa devido à sua natureza robusta e capacidade de resolução comprovada; no entanto, nem todos os géis de sílica são criados igualmente. Um gel de sílica de fase reversa ideal deve contemplar
o seguinte: 

• Estabilidade alcalina: Como o material bruto é carregado com muitas impurezas diferentes, as colunas precisarão necessariamente de limpeza regular com agentes cáusticos entre os ciclos. O CIP é um procedimento amplamente utilizado para remover peptídeos fibrilados e autoagregados do lado da entrada do leito de sílica na coluna. Esse procedimento de regeneração deve ser repetido periodicamente para manter a resolução, a separação dos picos e a baixa contrapressão da coluna. Isso enfatiza a necessidade de um gel de sílica quimicamente compatível com condições alcalinas de até 0,1 M de NaOH para limpeza.
• Capacidade de ligação: Essa é uma característica essencial para melhorar a economia da separação. Com uma capacidade de carga mais alta, uma quantidade maior de peptídeo recombinante pode ser purificada em cada ciclo.
• Robustez mecânica: Em alguns casos, as colunas de escala preparatória ou de produção precisarão
  ser desempacotadas e reempacotadas para melhorar a eficiência da coluna e prolongar a vida útil da mídia. Isso exige uma sílica gel com alta resistência mecânica para suportar vários empacotamentos por compressão axial.

Uma nova fase estacionária projetada para purificação de peptídeos complexos

Anos de trabalho incansável de pesquisa e desenvolvimento na DAISOGEL levaram ao projeto e à fabricação da mais avançada fase estacionária à base de sílica para resolver esses desafios extraordinários, que chamamos de Série PK. 

Com um tamanho de partícula de 10 µm para alta resolução e um tamanho de poro de 100 Å para maior capacidade de carga, também desenvolvemos a série PK com nossa avançada tecnologia de modificação de superfície, o que resulta em uma tolerância de pH imbatível em comparação com outras sílica gel de fase reversa do mercado. Além disso, sua espinha dorsal de sílica especialmente projetada e fabricada fornece a resistência mecânica extra às partículas de sílica. Para testar os recursos da PK Series em condições reais, realizamos um estudo de caso rigoroso para purificar uma amostra de insulina bruta.

ESTUDO DE CASO: Aplicação da série PK para obter >99% de pureza na insulina bruta

Nesta nota técnica, demonstraremos como a série PK foi capaz de trazer uma alimentação de insulina bruta de apenas 72,5% de pureza e aumentar a pureza para mais de 99%. A pureza inicial da amostra bruta foi verificada por uma análise de HPLC analítica, conforme mostrado abaixo.

Como visto acima, a baixa qualidade da solução de alimentação bruta dificultou a modelagem downstream. Uma etapa bem executada de cromatografia de troca catiônica forte baseada em polímero (não mostrada) foi usada para elevar a pureza a 88,0%. Para atingir a pureza final desejada, foram empregadas duas etapas de RPC usando a série PK.

RPC Etapa 1: gradiente ACN contra sulfato de amônio
ácido sulfúrico na série C8-PK

Na primeira etapa de RPC, uma coluna de preparação DAISOGEL SP-100-10-C8-PK foi sobrecarregada com 15 g/L de insulina purificada por IEX. Com a meta de 90% de rendimento, um gradiente de acetonitrila foi aplicado contra um fundo de sulfato de amônio/ácido sulfúrico sob as condições mostradas abaixo.

O pico de insulina foi coletado e analisado. Os resultados analíticos de HPLC do pool da Etapa 1 do RPC indicam
que, com 90% de rendimento, foi obtida uma pureza de 97,0%, conforme mostrado abaixo.

RPC Etapa 2: gradiente de ACN contra acetato de amônio
ácido acético na série C8-PK

Para atingir a pureza >99,0% desejada, foi empregada uma segunda etapa de RPC. Uma coluna de preparação DAISOGEL SP-100-10-C8-PK foi sobrecarregada com 15 g/L de insulina purificada por RPC1. Com a mesma meta de 90% de rendimento, foi aplicado um gradiente de acetonitrila, mas desta vez contra um fundo de acetato de amônio/ácido acético, sob as condições mostradas abaixo.

O pico de insulina foi novamente coletado e analisado. Os resultados analíticos de HPLC do pool da etapa 2 do RPC indicam que, com 90% de rendimento, foi obtida com sucesso uma pureza de 99,7%, conforme mostrado abaixo. 

Conclusão

Os peptídeos recombinantes são complexos por natureza e difíceis de purificar, sendo a insulina um exemplo clássico. Aumentar a pureza desses compostos para mais de 99% sem sacrificar o rendimento é importante tanto para a segurança do produto quanto por razões econômicas. A sílica gel DAISOGEL Série C8-PK foi selecionada para purificar um material de insulina bruta de baixa pureza devido à sua alta área de superfície, capacidade de carga, resistência mecânica e poder de resolução. 

Ao empregar uma purificação RPC em duas etapas após uma etapa IEX, conseguimos atingir 99,7% de pureza sem sacrificar o rendimento.