Incluso las columnas bien empaquetadas perderán parte de su eficacia durante largos períodos de uso de muchos ciclos, especialmente cuando se utilizan con muestras de alto nivel de impurezas. Si su columna se utiliza para la purificación de péptidos sintéticos o recombinantes o, en el peor de los casos, para la purificación de péptidos agregados y fibrilantes, el rendimiento de la columna puede disminuir con bastante rapidez.
La primera señal de alarma suele ser el aumento de la contrapresión de la columna. El deterioro de la forma de los picos o el descenso del número de platos teóricos puede ser otra señal de que necesita limpiar el péptido fibrilado que se acumula en el lado de entrada del lecho de sílice de su columna.
Consejo útil: realice el paso de lavado con flujo invertido. ¡No quiere que la basura se desplace por la columna!
Su fase estacionaria es una inversión costosa, así que ¿cómo puede prolongar su vida útil o regenerar su columna empaquetada que ha empezado a degradar su rendimiento?
Como primer paso, el lavado de la columna con un disolvente orgánico del 90 al 100 % nunca es perjudicial, y este sencillo paso suele ser de gran ayuda. Consejo útil: realice el paso de lavado con flujo invertido. No querrá que la basura se desplace por la columna.
¿Qué disolvente debe utilizarse para las regeneraciones?
Los péptidos normalmente interactúan a través de múltiples interacciones con la sílice: interacciones hidrofóbicas, electrostáticas silanófilas, enlaces de hidrógeno, etc. Por lo tanto, es fundamentalmente importante suprimir TODAS las interacciones para una regeneración exitosa de la columna. También es importante suprimir las interacciones intermoleculares péptido-péptido.
La urea, el hidróxido de amonio y el Tris son agentes bien conocidos para suprimir las interacciones peptídicas. Tris
(10 mM, pH = 9-10) es un agente excelente para evitar la agregación de péptidos y para disolverlos. Y por supuesto, el pH también tendrá un gran impacto para suprimir y disolver. El pH adecuado para implementar es difícil de predecir y depende en gran medida del punto isoeléctrico del péptido.
En general, se necesitará alrededor de un 50-60% de disolvente orgánico para suprimir las interacciones hidrofóbicas, y se necesitarán cationes (por ejemplo, amonio, sodio, aminas) para suprimir las interacciones silanófilas.
Esta es la clave para permitir que se produzca la degradación de las impurezas enganchadas; la desvinculación de la agregación combinada con el efecto de desorción del disolvente orgánico, que arrastra los fragmentos de fibrillas peptídicas desvinculadas. Esta es la "doble acción" necesaria para el éxito de la limpieza de la columna y ayudará a prolongar su vida útil.
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