Mesmo colunas bem empacotadas perderão parte de sua eficiência durante longos períodos de uso de muitos ciclos, especialmente quando usadas com amostras de alto nível de impureza. Se a sua coluna for usada para purificação de peptídeos sintéticos ou peptídeos recombinantes ou, na pior das hipóteses, para purificação de peptídeos agregados e fibrilados, o desempenho da coluna poderá diminuir rapidamente.
O primeiro sinal de alerta geralmente é o aumento da contrapressão da coluna. A deterioração do formato do pico ou a queda no número de placas teóricas pode ser outro sinal de que você precisa limpar o peptídeo fibrilado que se acumula no lado de entrada do leito de sílica da coluna.
Dica útil: execute a etapa de lavagem com fluxo reverso. Você não quer que o lixo passe pela coluna!
Sua fase estacionária é um investimento caro, portanto, como você pode estender sua vida útil ou regenerar sua coluna empacotada que começou a apresentar degradação de desempenho?
Como primeira etapa, lavar sua coluna com 90 a 100% de solvente orgânico nunca é prejudicial, e essa simples etapa geralmente ajuda! Dica útil: execute a etapa de lavagem com fluxo reverso. Você não quer que o lixo passe pela coluna!
Qual solvente deve ser usado para as regenerações?
Os peptídeos normalmente interagem com a sílica por meio de várias interações: interações hidrofóbicas, eletrostáticas silanofílicas, ligações de hidrogênio, etc. Portanto, é de fundamental importância suprimir TODAS as interações para que a regeneração da coluna seja bem-sucedida. Também é importante suprimir as interações intermoleculares peptídeo-peptídeo.
A ureia, o hidróxido de amônio e o Tris são agentes bem conhecidos para suprimir as interações peptídicas. O Tris
(10 mM, pH = 9-10) é um excelente agente para evitar a agregação de peptídeos e dissolvê-los. E, é claro, o pH também terá um grande impacto na supressão e na dissolução. É difícil prever o pH adequado a ser implantado e ele depende muito do ponto isoelétrico do peptídeo.
Em geral, você precisará de cerca de 50-60% de solvente orgânico para suprimir as interações hidrofóbicas e precisará de cátions (por exemplo, amônio, sódio, aminas) para suprimir as interações silanofílicas.
Essa é a chave para permitir que ocorra a degradação das impurezas presas; o desacoplamento da agregação combinado com o efeito de dessorção do solvente orgânico, que leva embora os fragmentos de fibrilas de peptídeos desacoplados. Essa é a "ação dupla" necessária para a limpeza bem-sucedida da coluna e ajudará a prolongar a vida útil da coluna.
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